斑馬魚17α，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP)ELISA檢測試劑盒

使用說明書

檢測范圍

0.625ng/ml--20ng/ml

檢測原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中斑馬魚17α，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP)水平。用純化的斑馬魚17α，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入斑馬魚17α，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP)，再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的斑馬魚17α，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中斑馬魚17α，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP)含量。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

酶標儀（450nm）

高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

37℃恒溫箱

蒸餾水或去離子水

操作注意事項

嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

在儲存和溫育時避免強光直接照射。

平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

不能使用過期產(chǎn)品。

如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑盒組成

備注：

1.  標準品濃度依次為：20、10、5、2.5、1.25、0.625ng/ml.

2.  經(jīng)過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。

試劑的準備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

洗板方法

手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

  樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

  除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷

 繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。